イネ遺伝子の書換を容易にするゲノム編集技術を開発

愛媛大学大学院 農学研究科の賀屋秀隆 准教授（元 農研機構 特別研究員）、農業・食品産業技術総合研究機構（農研機構）の土岐精一 ユニット長らのグループは、イネの遺伝子を標的としてアデニン (A) からグアニン (G)への塩基置換を可能とする技術について、標的範囲を拡張できる新たな技術を開発しました。

ゲノム編集ツールであるCRISPR/Cas9を利用する際DNA配列上にPAMとよばれる特定配列の制限があります。最も広く利用されているStreptococcus pyogenes由来のSpCas9のPAM配列はNGG（Nは任意の塩基、Gはグアニン）で、最も小さく、昨年、この制限をNGへと低減させた新しいタイプのSpCas9-NGが報告されました。一方、通常のゲノム編集では、塩基の欠失・挿入による遺伝子破壊がほとんどで、遺伝子の機能を制御できる塩基置換の頻度は非常に低く、起こっても置換パターンがランダムでした。最近、狙った位置にある A（アデニン）をG（グアニン）に置換できる技術が開発され、今回、この２つの技術を融合させることで、イネのゲノム編集において、PAMによる制限の少ないSpCas9-NGv1によりAをGに塩基置換できることを明らかにしました。

この技術をさらに検証し、イネ以外の植物、例えば愛媛県の最重要作物であるカンキツでも適応可能であることを検証したいと考えています。

CRISPR/Cas9はゲノム編集ツールの一つで、狙った位置にある遺伝子を、簡便かつ効率的に改変することができるといわれている技術である。実際、狙った遺伝子を潰すという目的では、十分に機能を果たしている。ただ、思い通りに改変するという目的には、まだ道のりは長い。その大きな理由の一つが、PAMによる制限である。なぜなら、Cas9によるDNA切断において、PAM配列は必須で、PAM配列があるところでしかゲノム編集できないからである。最も広く使用されているStreptococcus pyogenes由来のSpCas9のPAM配列は、今のところ最も小さいNGGである（Nは任意の塩基）。もう一つの理由は、Cas9により誘導される変異パターンである。SpCas9による変異のほとんどが塩基欠損あるいは塩基挿入であり、塩基置換は非常に希で、さらにその置換パターンもランダムである。遺伝子の機能を潰すという点では、塩基欠損・挿入で十分であるが、機能を制御するという目的では狙った塩基を、望む塩基に置換することが必要である。

昨年、東京大学の濡木教授・西増助教らのグループから、PAM配列がNGGに加えて、NGA、 NGC、 NGTにも対応できるように改良されたSpCas9-NGが報告された。また、米国 Liu博士らからは、アデノシンデアミナーゼを用いて、狙った位置のアデニン (A) をグアニン (G) に塩基置換できるという技術が報告されている。

今回、農業・食品産業技術総合研究機構（農研機構）生物機能利用研究部門 遺伝子利用基盤研究領域 先進作物ゲノム改変ユニットの土岐精一 ユニット長、愛媛大学大学院 農学研究科の賀屋秀隆 准教授（元 農研機構 特別研究員）らのグループは、両方の技術を融合し、イネの遺伝子を改変することを試みた。まず、SpCas9-NGv1 に変異を入れ、DNAを完全には切断できないようにしたnSpCas9-NGv1を作成した。これに、アデニンをグアニンに塩基置換できるアデノシンデアミナーゼを融合させたものを作成し、イネに発現させた。その結果、標的とした遺伝子で、アデニンがグアニンに塩基置換されていることを明らかにした。

今後は、イネ以外の植物、例えば愛媛県の最重要作物であるカンキツなどにおいても、この技術が適用できることを検証したいと考えている。

【用語説明】

CRISPR/Cas9:
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/ CRISPR associated protein 9の略。ゲノム編集ツールの一つで，第３世代。他には，第１世代のZinc-finger nuclease (ZFN), 第２世代のTranscription activator-like effector nucleases (TALENs) がある。細菌由来であるCas9には，多様なタイプが存在するが，中でもStreptococcus pyogenes由来のSpCas9が最も広く使用されている。SpCas9は，PAMと呼ばれるDNA配列 (NGG) を認識し，PAMの上流3–4塩基の間でDNAを切断する。Gはグアニン，Nはanyの略で，A/C/G/Tいずれかの塩基を指す。

PAM：
protospacer adjacent motifの略．Cas9は，それぞれ固有のPAM配列を認識する。SpCas9が認識するPAMは，今のところ最小である。すなわち，PAMによる制限が最も低いCas9である。

SpCas9-NG:
昨年，東京大学の濡木教授・西増助教らのグループが開発した新しいSpCas9．SpCas9-NGは，PAMとしてNG配列を認識する。

sgRNA:
single guide RNAの略．sgRNAはCas9と複合体を形成する。Cas9はsgRNAがもつ20数塩基の配列と相補的な配列のDNAを切断する。

塩基置換：
DNAは，4種類の塩基（アデニンA, シトシンC, グアニンG, チミンT）で構成されている。塩基置換は，4種類の内の1つの塩基が別の塩基に置き換わること。今回のゲノム編集技術では，アデニン(A)をグアニン(G)に置き換えることができた。通常のゲノム編集技術では，塩基の欠失や挿入がほとんどである。塩基の欠失や挿入は，遺伝子の機能を破壊してしまうことが多い。一方，塩基置換は，酵素の活性を調節することも可能である。

アデノシンデアミナーゼ：
アデニンのアミノ基を除くことで，最終的にアデニンをグアニンに変換することができる酵素。

参考 URL: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.13120

論文情報

【掲載誌】Plant Biotechnology Journal
【題名】An adenine base editor with expanded targeting scope using SpCas9-NGv1 in rice（イネにおいて，改良型SpCas9-NGv1を用いることでアデニン塩基置換変異の広範囲での利用が可能となる）
【著者】Katsuya Negishi, Hidetaka Kaya, Kiyomi Abe, Naho Hara, Hiroaki Saika, Seiichi Toki
【DOI】10.1111/pbi.13120

助成金等

• 内閣府戦略的イノベーション創造プログラム（SIP)「次世代農林水産業創造技術」（平成26－30年度）（管理法人：農研機構生研支援センター）

図表等

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  内閣府戦略的イノベーション創造プログラム（SIP)「次世代農林水産業創造技術」（平成26－30年度）（管理法人：農研機構生研支援センター）

  SpCas9のPAMによる標的配列の制限はNGGであるが、改良型SpCas9-NGv1ではNGとなる。この改良型SpCas9-NGv1とアデノシンデアミナーゼ (adenine deaminase) と融合することで、アデニン (A) から グアニン (G) への塩基置換変異の適用範囲が広くなる。

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